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需求描述
备注：Linux系统，目前只需将以下分析工作形成pipeline，做成打包程序（以下多数内容我们已经掌握分析方法）。如果有能力做其他相关分析，可详谈。项目制，价格根据内容详谈
16S rRNA 基因测序数据分析
一、原始数据处理
1. 拆分(demultiplex)：将barcode从reads上去掉；
2. 质量控制（quality control）：
1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；
2）根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；
3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；
（美吉使用软件：FLASH、Trimmomatic）
3.去除嵌合体（chimeric sequence）
4.去除Chloroplast-Mitochondria-unknown-Archaea-Eukaryota
5.OUT聚类
SILVA v132
二、后续分析
1. α多样性分析
多样性：Shannon指数，Inverse Simpson指数
丰富度：sobs, ace chao
均匀度：Shannoneven, Simpsoneven
2.稀释曲线
3.物种组成分析
柱状图，Venn图，Heapmap图 （vegan）
4.β多样性：
距离计算方法：Bray-Curtis， Euclidean，weighted/unweighted UniFrac
Ordination: PCA, PCoA, NMDS
统计方法：Anosim, PERMANOVA(Adonis), PLS-DA
5.差异物种
LEfSe
6.代谢通路预测
7.Network网络分析
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一、原始数据处理
1. 拆分(demultiplex)：将barcode从reads上去掉；
2. 质量控制（quality control）：
1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；
2）根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；
3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；
（美吉使用软件：FLASH、Trimmomatic）
3.去除嵌合体（chimeric sequence）
4.去除Chloroplast-Mitochondria-unknown-Archaea-Eukaryota
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4.β多样性：
距离计算方法：Bray-Curtis， Euclidean，weighted/unweighted UniFrac
Ordination: PCA, PCoA, NMDS
统计方法：Anosim, PERMANOVA(Adonis), PLS-DA
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LEfSe
6.代谢通路预测
7.Network网络分析
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3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；
（美吉使用软件：FLASH、Trimmomatic）
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